Die einleitende Filmsequenz beschreibt die jahrhundertelange Suche des Templerordens nach dem sagenumwobenen Apfel von Eden, welcher die Saat des ersten menschlichen Ungehorsams und des freien Willens enthält. Im Jahr 1492 steht ihrer Suche in Andalusien die Bruderschaft der Assassinen im Weg, welche das Sultanat Granada vor der Übernahme durch die Templer schützen will. Einer dieser Assassinen ist Aguilar de Nerha.
Im Jahr 1986 widerfährt Callum Lynch als kleiner Junge das Schicksal, dass seine Mutter von seinem Vater getötet wird. Dreißig Jahre später, im Jahr 2016, befindet sich Callum wegen eines Mordes im Todestrakt des Staatsgefängnisses von Huntsville in Texas und wartet auf die Vollstreckung seines Todesurteils mittels Giftspritze.
Dort wird er zur Teilnahme am sogenannten Animus-Projekt gezwungen, welches ihn mittels eines Computersystems in die Erinnerungen seines Vorfahren Aguilar de Nerha eintauchen lässt. De Nerha war ein Auftragsmörder (Assassine), der im 15. Jahrhundert zu Zeiten der Spanischen Inquisition lebte. Durch die Zeit im Animus hat Callum sowohl Halluzinationen über Aguilar als auch über andere Vorfahren, was die leitende Forscherin bei Abstergo, Dr. Sofia Rikkin, als „Sickereffekt“ bezeichnet. Durch diesen Effekt eignet sich Callum Wissen und Fertigkeiten seines Vorfahren an.
Mit Hilfe dieser Fähigkeiten nehmen es Callum und andere in der Forschungsstation lebende Assassinen (ebenfalls befreit von ihrer Lethargie) schließlich in der Gegenwart mit den Mitgliedern des Templerordens auf, welche seit jeher die Feinde der Assassinen darstellen. Es kommt zu heftigen Kämpfen zwischen den Assassinen und den Sicherheitskräften der Forschungsanlage.
Sofia und ihr Vater flüchten aus der Einrichtung mit einem Hubschrauber Richtung Sevilla, um dort nach einem Hinweis aus Callums Erinnerungen im Animus in der Kathedrale von Sevilla im Grab von Christoph Kolumbus den Apfel zu finden.
Bei einem Treffen der Mitglieder des Templerordens im Templer-Saal in London zur Feier der Wiedererlangung des Apfels lässt das Wissen um den baldigen Missbrauch der genetischen Information durch die Templer die Wissenschaftlerin an ihrem Projekt und an dem Vorhaben ihres Vaters zweifeln. Callum und andere Assassinen mischen sich unter die Anwesenden im Templer-Saal und schaffen es, den Apfel der ersten Sünde in ihre Hände zu bringen. Nachdem Callum Sofias Vater getötet hat, schwört Sofia das Artefakt für die Templervereinigung zurückzuholen und Callum zu finden.
Die Schlussszene des Filmes zeigt drei Assassinen über den Dächern Londons.
Der Film beruht auf der Videospielreihe Assassin’s Creed des französischen Publishers Ubisoft.
Der Film kam am 21. Dezember 2016 in Frankreich und den Vereinigten Staaten in die Kinos. Der Kinostart in Deutschland erfolgte am 27. Dezember 2016
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